СВЕРДЛОВСКОЕ ОБЛАСТНОЕ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОЕ ОБЪЕДИНЕНИЕ "ФТИЗИОПУЛЬМОНОЛОГИЯ"

Отчет о НИОКР "ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ИЗДЕЛИЯ МЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ "БИОФОН" НА МИКОБАКТЕРИИ И ОЦЕНКА ЕГО ЭФФЕКТИВНОСТИ"

Научный руководитель: д.м.н Г.Г.Мордовской;

Екатеринбург 1999 г.

СОДЕРЖАНИЕ:

ВВЕДЕНИЕ *

1. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИ АППАРАТА "БИОФОН" НА МИКОБАКТЕРИИ *

2. ИЗУЧЕНИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ АППАРАТА "БИОФОН" НА ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ *

3. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ИНФРАКРАСНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ АППАРАТА "ФТИЗИО-БИОФОН" НА БОЛЬНЫХ С УРОГЕНИТАЛЬНЫМ ТУБЕРКУЛЕЗОМ. *

ЗАКЛЮЧЕНИЕ *

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ *

РЕФЕРАТ

Отчет 39с., 13 табл., 8 источников

АППАРАТ "БИОФОН", МИКОБАКТЕРИИ, ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ЖИВОТНЫЕ, БОЛЬНЫЕ УРОГЕНИТАЛЬНЫМ ТУБЕРКУЛЕЗОМ, МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ, БЕЗОПАСНОСТЬ.

Объектом исследования являлись: аппарат медицинского назначения "Биофон", микроорганизмы рода Mycobacterium, экспериментальные животные, больные урогенитальным туберкулезом.

Цель работы Провести оценку медико-биологической эффективности и безвредности изделия медицинского назначения "Биофон" для лечения туберкулезной инфекции.

В работе использованы микробиологические, биохимические, клинические, иммунологические и биологические методы исследований.

В процессе выполнения работы были изучены: влияние аппарата "Биофон" на микобактерии, воздействие аппарата на экспериментальных животных и организм человек (ограниченная группа больных урогенитальным туберкулезом).

В результате проведенных исследований установлено:

1. Облучение аппаратом "Биофон" оказывает угнетающее воздействие на ротовую активность вирулентных штаммов МБТ, стимулируя рост авирулентных микобактерий в опытах in vitro. Выявлена прямая зависимость задерживающего эффекта развития микобактерий от степени вирулентности.
2. Облучение аппаратом "Биофон" усиливает туберкулостатическое действие изониазида, стрептомицина и этамбутола на чувствительный тест-штамм МБТ. Кроме того, аппарат "Биофон" оказывает определенное воздействие на степень устойчивости микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам. Наиболее существенные изменения отмечены в устойчивости к стрептомицину (повышение степени устойчивости), а также к рифампицину и канамицину (снижение степени устойчивости).
3. Воздействие аппарата "Биофон" на организм лабораторных животных: белых мышей и морских свинок не вызывает гибели животных, изменений в поведении, состоянии волосяного покрова и слизистых оболочек, отказа от корма и воды, потери в весе, а также на показатели клеточного звена иммунитета.
4. Применение аппарата "Биофон" для лечения экспериментального туберкулеза позволяет снизить активность проявления специфических поражений. Сочетанное использование облучения с лечением изониазидом повышает химиотерапевтическую активность препарата.
5. Использование облучения аппаратом "ФтизиоБиофон" для лечения больных урогенитальным туберкулезом (ограниченная группа, добровольцы) не оказывает значительного влияния на гематологические и иммунологические показатели крови.

Проведенные биохимические исследования у больных урогенитальным туберкулезом после воздействия на них инфракрасного излучения аппарата "ФтизиоБиофон" не выявили статистически значимых отклонений от физиологических норм показателей, характеризующих функции печени.

Для полной и объективной оценки эффективности и безопасности аппарата необходимо проведение дополнительных исследований на расширенном контингенте больных урогенитальным туберкулезом.

ВВЕДЕНИЕ

Социальная значимость проблемы туберкулеза неоспорима и ярко проявляется при кризисе экономики России в последнее десятилетие уходящего века. Туберкулез является одной из наиболее распространенных и вместе с тем наиболее опасных для человека хронических инфекций. Возбудитель туберкулеза относится к обширной группе микобактерий, которые распространены повсеместно на земле и могут размножаться в организме человека и животных, а также накапливаться в окружающей среде. В настоящее время известны более 100 видов микобактерий, из которых Myc. tuberculosis и Myc. bovis относятся к наиболее патогенным видам, вызывая туберкулез у человека и сельскохозяйственных животных.

В течение последних пяти лет в Российской Федерации отмечается резкое ухудшение эпидемиологической ситуации по туберкулезу, что проявляется ростом показателей заболеваемости и смертности. Несомненно, что в 21 веке туберкулез будет одной из важных проблем национального и международного здравоохранения, так как увеличение распространенности этой инфекции имеет место не только в России, но и в других странах (А.Г. Хоменко, 1997). На этом фоне в последние годы среди вновь выявленных больных туберкулезом отмечается увеличения числа иммунодефицитных состояний различного генеза (В.И. Литвинов, 1997). Резкий рост числа случаев заболевания туберкулезом практически во всех странах является следствием возрастания частоты поражения больных штаммами микобактерий с множественной лекарственной устойчивостью (Н.М. Рудой, 1996; J.S. Blanchard, 1996). В настоящее время известно, что лекарственная резистентность микобактерий туберкулеза развивается ко всем существующим противотуберкулезным препаратам. Трудности современной химиотерапии туберкулезом во многом связаны с возрастанием в его этиологии роли микобактерий с природной или приобретенной устойчивостью к большинству используемых препаратов. Несмотря на применение различных комбинаций туберкулостатических средств в настоящее время не удается во всех случаях предотвратить появление лекарственной устойчивости при длительном лечении больных туберкулезом, особенно с распространенными деструктивными формами заболевания. Вместе с тем, с увеличением числа противотуберкулезных препаратов и длительности их применения большую актуальность приобретает проблема побочного токсико-аллергического действия лекарств на организм больного. Риск возникновения побочных реакций увеличивается в условиях современных методов применения многих препаратов.

Таким образом, рост заболеваемости туберкулезом, а также появление полирезистентных форм микобактерий затрудняет эффективность химиотерапии. Сложившаяся ситуация вынуждает искать новые подходы к лечению туберкулезной инфекции.

В этой связи, интерес представляет аппарат медицинского назначения "Биофон", который предназначен для лечения туберкулеза в сочетании с химиотерапией.

Целью настоящего исследования являлась оценка медико-биологической эффективности и безвредности изделия медицинского назначения "Биофон" для лечения туберкулезной инфекции.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие основные задачи:

1. Изучить влияние аппарата "Биофон" на микобактерии in vitro.
2. Изучить воздействие аппарата "Биофон" в опытах на экспериментальных животных.
3. Изучить влияние аппарата "Биофон" на организм человека (ограниченная группа больных урогенитальным туберкулезом).

При выполнении работы использованы микробиологические, биохимические, клинические, иммунологические и биологические методы исследований.

Примененные методы и использованная литература приведены в соответствующих разделах отчета. Исследования по теме проведены в соответствии с договором № 1364 от 19.01.99. (продолжение договоры № 1562 от 13.04.99. и № 1714 от 23.06.99.)

1. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИ АППАРАТА "БИОФОН" НА МИКОБАКТЕРИИ

Цель работы Изучить влияние низкочастотного электромагнитного излучения аппарата "Биофон" на ростовые свойства и лекарственную чувствительность микобактерий.

Материалы и методы В работе использованы 5 лабораторных тест-штаммов микобактерий, полученных из Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича (ГИСК) и 72 штамма микобактерий туберкулеза (МБТ), выделенные от больных, находящихся на лечении в противотуберкулезных учреждениях Свердловской области. В группу тест-штаммов включены штаммы МБТ человеческого вида – H₃₇Rv (вирулентный) H₃₇Ra (авирулентный), бычьего вида – Bovinus 8 (вирулентный), птичьего вида – Avium (вирулентный), а также сапрофитный штамм Myc. Smegmatis. Во вторую группу вошли выделенные от больных МБТ, чувствительные к противотуберкулезным препаратам – 37 штаммов и проявившие устойчивость разной степени – 35 штаммов.

Для культивирования указанных штаммов микобактерий в параллельных опытах использовались одномоментно приготовленные лабораторные серии питательных сред Левенштейна-Иенсена и "Новая", приготовленная в соответствии с рецептурой и технологией (Г.Г. Мордовской, 1972;4 В.Н. Васильев, 1974).

Для изучения ростовой активности взвесь микобактерий готовили по стандарту мутности ГКИ 10 единиц в разведении 10 единиц, 10^-1, 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6, а также в более высокой концентрации 100 единиц. Приготовленную взвесь засевали в количестве 0,1 мл на поверхность питательной среды Левенштейна-Иенсена. Учитывали скорость роста и выход микробной массы, путем подсчета видимых невооруженным глазом колоний на каждой питательной среде.

Изучение лекарственной чувствительности проводили по общепринятым методикам (Т.И. Козулицына с соавт., 1978).

1. Изучение влияния аппарата "Биофон" на ростовые свойства микобактерий.

Проведена отработка методики по оптимизации воздействия аппарата на микобактерии туберкулеза. Были использованы лабораторные штаммы H₃₇Rv, H₃₇Ra. Основные исследования проводились по предложенной схеме обозначенной в инструкции. Дополнительные исследования проведены на тех же штаммах микобактерий с 10-^и, 20-^и, 50-^и, 100- кратном увеличением сеансов облучения, а также с изменением схемы облучения.

Выявлено угнетение роста вирулентных штаммов H₃₇Rv Bovinus 8 и Avium во всех сериях независимо от кратности и длительности облучения. Наибольшие различия между микобактериями, подвергшимися облучению и контрольными (не облученными) отмечались на 12-15 сутки и 28-35 сутки. Результаты представлены в таблицах 1 и 2.

В среднем замедление скорости роста лабораторных вирулентных штаммов, подвергшихся облучению, составило 60-85% по сравнению с контролем, выход микробной массы уменьшился на 35-47%.

В результате исследования воздействия аппарата "Биофон" на вирулентные культуры микобактерий туберкулеза, выделенные от больных (37 культур), выявлено также удлинение сроков роста микобактерий на 75% и сокращение выхода микробной массы на 15-70%.

Таблица 1

Исследование влияния облучения аппарата "ФтизиоБиофон" на скорость роста и выход микробной массы МБТ в зависимости от величины микробной нагрузки.

Таблица 2

Воздействие аппарата "Биофон" на ростовые свойства микобактерий.

1.2. Изучение влияния аппарата "Биофон" на лекарственную чувствительность микобактерий.

1.2.1. Проведено изучение сочетанного влияния инфракрасного излучения и противотуберкулезных препаратов на микобактерии туберкулеза методом вертикальной диффузии. Использован лабораторный штамм микобактерий туберкулеза H₃₇Rv. Взвесь микобактерий с нагрузкой микробной массы 100 ед. и 10 ед. засевали на питательную среду, затем в пробирки добавляли по 0,3мл рабочих разведений противотуберкулезных препаратовизониазид – 0,1-1 мкг/мл, стрептомицин – 5-50 мкг/мл, рифампицин - 20-50 мкг/мл, каномицин 30-50 мкг/мл, этамбутол – 2-5 мкг/мл, пиразинамид – 20-50 мкг/мл. Туберкулостатический эффект определялся по величине зон задержки роста микобактерий на питательной среде. Данные отражены в таблице 3.

Таблица 3

Туберкулостатическая активность противотуберкулезных препаратов в сочетании с излучением.

Определено, что инфракрасное облучение усиливает туберкулостатическое действие изониазида, стрептомицина и этамбутола: зоны задержки роста микобактерий увеличились для тубазида на 20,7 %, стрептомицина – на 21,1% и этамбутола на 20,3% по сравнению с необлученным контролем.

1.2.2. Проведено изучение влияния инфракрасного излучения аппарата "Биофон" на характер устойчивости микобактерий туберкулеза противотуберкулезным препаратам.

В работе использованы 35 культур МБТ, выделенных от больных туберкулезом легких, у которых была определена чувствительность к основным противотуберкулезным препаратам. В соответствии с существующими критериями культуры считались устойчивыми при наличии роста на питательной среде, содержащей >1 мкг/мл тубазида, >5 мкг/мл стрептомицина, >20 мкг/мл рифампицина, >20 мкг/мл канамицина, >2 мкг/мл этамбутола, >2 мкг/мл тибона. Из числа исследованных культур 17 проявили устойчивость к одному (5 культур), двум (10 культур) или трем препаратам (2 культуры). Остальные 18 были чувствительны ко всем перечисленным препаратам.

Изучена степень устойчивости к минимальным дозам противотуберкулезных препаратов, в следующих концентрациях: 0,1; 0,2 и 0,5 мкг/мл; стрептомицин – 0,5; 1,0; 2,0 мкг/мл; рифампицин – 2,0; 5,0; 10,0 мкг/мл; каномицин – 2,0; 5,0; 1,0 мкг/мл; этамбутол – 0,2; 0,5; 2,0 мкг/мл; тибон – 0,2; 0,5; 1,0 мкг/мл.

Определение проводили методом абсолютных концентраций на плотной среде "Новая". Готовили взвесь МБТ по стандарту мутности 10 единиц ГКИ, разводили 1:10 и засевали по 0,1 мл в пробирке с питательной средой, содержащей различные концентрации препаратов. Посевы инкубировали в горизонтальном положении при 37⁰ в течение 12 суток.

В эксперименте проводили облучение засеянных пробирок аппаратом "Биофон" по отработанной схеме. Результаты представлены в таблицах 4,5 и 6.

Таблица 4

Влияние инфракрасного излучения на степень устойчивости чувствительных микобактерий к микродозам препаратов

Таблица 5

Влияние инфракрасного излучения на уровень устойчивости МБТ к противотуберкулезным препаратам

Таблица 6

Влияние инфракрасного излучения на степень устойчивости МБТ

Чувствительность к тубазиду.

Культуры, чувствительные ко всем противотуберкулезным препаратам, в подавляющем числе случаев (16 культур из 18) не проявили устойчивости к микродозам тубазида. Она отмечена лишь у 2-х культур (к 0,5 мкг/мл). Из 13 культур, устойчивых к другим препаратам, но чувствительных к 1 и более мкг/мл тубазида, развитие начальной устойчивости отмечено у 11 культур (в основном в дозе 0,5 мкг/мл). Как облученные, так и не облученные культуры проявили одинаковую степень устойчивости к малым концентрациям тубазида, только у одной культуры под влиянием излучения она повысилась с 0,2 до 0,5 мкг/ мл. У 4-х культур, устойчивых к более высоким концентрациям тубазида (>1 мкг/мл) также не выявлено различий в степени устойчивости у облученных и необлученных культур.

Чувствительность к стрептомицину.

Половина культур, чувствительных к основным противотуберкулезным препаратам проявила устойчивость к минимальным концентрациям стрептомицина (9 из 18).

При облучении "Биофоном" у 3-х из этих культур появилась устойчивость к 0,5 мкг/мл препарата, в то время как необлученные – оставались чувствительными. Еще у 2-х культур отмечено повышение степени устойчивости (с 0,5 до 1 и с 0,5 до 2 мкг/мл) под воздействием инфракрасного излучения. В одном случае применение облучения привело к снижению устойчивости (с 1 до 0,5 мкг/мл), а для трех культур оно не влияло на уровень последней.

Из 17 устойчивых культур 14 были устойчивых >5 мкг/мл стрептомицина, причем степень устойчивости у них не изменилась под воздействием облучения, за исключением 1 культуры, у которой отмечено снижение с 10 до 7,5 мкг/мл.

Три культуру были устойчивы к другим противотуберкулезным препаратам, но чувствительны к >5 мкг/мл стрептомицина, причем у одной из них устойчивость к 0,5 мкг/мл препарата проявилась под воздействием облучения. У двух культур не выявлено различий в уровнях начальной устойчивости к стрептомицину между облученными и необлученными культурами.

Чувствительность к рифампицину.

Из 18 чувствительных культур только у трех отмечено развитие устойчивости к рифампицину (к 2 мкг/мл), причем у двух из них под влиянием инфракрасного излучения восстановилась чувствительность к этому препарату.

Четыре культуры из 17 устойчивых были устойчивы к 20-50 мкг/мл рифампицина и облучение не влияло на степень их устойчивости. Из 13 культур устойчивых к другим противотуберкулезным препаратам, но чувствительных к >20 мкг/мл рифампицина у трех отмечено снижение начальной чувствительности к этому препарату (в концентрациях 2-10 мкг/мл). Под действием облучения степень устойчивости у двух культур снизилась (с 10 до 5 мкг/мл), а у одной осталась без изменения (2 мкг/мл).

Чувствительность к канамицину.

У трети чувствительных культур (6) определено снижение чувствительности к канамицину в концентрациях 2-5 мкг/мл, причем в одном случае применение "Биофона" способствовало возникновению начальной устойчивости к 2 мкг/мл, а в другом к восстановлению чувствительности. На степень устойчивости четырех культур излучение не оказало влияния.

Только 3 из 17 устойчивых культур были устойчивы к канамицину в концентрациях >30 мкг/мл, воздействие облучения не изменило уровень устойчивости. 11 культур, устойчивых к другим препаратам проявили устойчивость к малым концентрациям канамицина, причем у двух из них под воздействием ИК излучения снизилась степень устойчивости, а в двух восстановилась устойчивость к препарату. Только у одной культуры отмечена обратная реакция – повышение степени устойчивости с 2 до 10 мкг/мл.

Чувствительность к этамбутолу.

Большинство чувствительных культур (15 из 18) проявили устойчивость к малым концентрациям этамбутола. У 6 из них облучение "Биофоном" вело к дальнейшему понижению чувствительности, а у двух – наоборот, к ее повышению. Остальные 7 культур под воздействием ИК излучения не изменили степень устойчивости к этамбутолу. 6 культур из 17 устойчивых были устойчивы к высоким концентрациям этамбутола, из них только у одной наблюдалось увеличение степени устойчивости под влиянием облучения. Из 11 культур, устойчивых к другим противотуберкулезным препаратам, но чувствительных к этамбутолу в концентрациях >2 мкг/мл устойчивость к этому препарату (к 0,5-1 мкг/мл) обнаружена у 9. При этом у 4-х культур отмечено снижение степени устойчивости к этамбутолу под воздействием облучения, а у одной – повышение.

Чувствительность к тибону.

Все 35 культур, использованных в работе, в той или иной степени проявили начальную устойчивость к тибону. Четыре из 18 устойчивых культур понизили чувствительность к этому препарату (в малых концентрациях 0,2-1 мкг/мл), а три, наоборот, повысили.

Устойчивые культуры также были устойчивы к малым концентрациям тибона, причем только у трех под воздействием излучения наблюдалось повышение степени устойчивости, у остальных 17 изменений не обнаружено.

Таким образом, инфракрасное излучение аппарата "Биофон" оказывало определенное воздействие на степень устойчивости микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам.

Наиболее существенные изменения отмечены в устойчивости к стрептомицину – у 50% культур, с начальной устойчивостью к этому препарату степень устойчивости под воздействием облучения повысилась. Напротив, у 66,7% культур с начальной устойчивостью к рифампицину и у 47,1% - к канамицину отмечено снижение степени устойчивости под воздействием инфракрасного излучения. У 56% культур, устойчивых к малым концентрациям этамбутола отмечены изменения в уровне устойчивости под воздействием "Биофона", однако, практически в равной степени как понижало, так и повышало степень устойчивости к препаратам.

Можно также отметить, что облучение практически не оказывало влияния на степень устойчивости МБТ к тубазиду и незначительно изменяло этот показатель для тибона.

Инфракрасное излучение практически не влияло на степень устойчивости МБТ к высоким концентрациям препаратов.

Установлено, что аппарат "Биофон" оказываем угнетающее воздействие на ростовую активность вирулентных штаммов МБТ, стимулируя рост авирулентных микобактерий в опытах in vitro. Выявлена прямая зависимость задерживающего эффекта развития микобактерий от степени вирулентности, что может быть использовано в лабораторной практике для дифференциальной диагностики биологических свойств микобактерий.

Проведенные исследования показали, что увеличение кратности сеансов облучения усиливает действие аппарата "Биофон" на микобактерии. Оптимальным признан режим облучения с интервалом 12 часов с 10-ти кратным увеличение сеансов облучения.

Облучение аппаратом "Биофон" усиливает туберкулостатическое действие изониазида, стрептомицина и этамбутола на чувствительный тест-штамм МБТ. Кроме того аппарат "Биофон" оказывает определенное воздействие на степень устойчивости микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам. Наиболее существенные изменения отмечены в устойчивости к стрептомицину (повышение степени устойчивости), а также к рифампицину и канамицину (снижение степени устойчивости).

2. ИЗУЧЕНИЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ АППАРАТА "БИОФОН" НА ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ

Отработка модели экспериментальной туберкулезной инфекции проводится с использованием лабораторных животных. Для определения влияния аппарата "Биофон" на развитие и течение туберкулеза нами использованы белые мыши и морские свинки. Применение для этой цели белых мышей позволяет в сравнительно короткие сроки получить предварительные достоверные результаты. Морские свинки ввиду их высокой восприимчивости к туберкулезу считаются наиболее подходящими для опытов по лечению туберкулеза (Г.Н. Першин, 1971).

2.1. Определение влияния аппарата "Биофон" на течение экспериментального туберкулеза у белых мышей.

В опыте использованы 120 половозрелых самцов, весом 18-22 г. Во время эксперимента животные содержались в стандартных условиях содержания и кормления. С целью развития туберкулеза было проведено внутривенное заражение рекомендуемой дозой 0,1мг суспензии культуры лабораторного штамма H₃₇Rv. Развитие туберкулеза тестировалось по общему состоянию животных (снижение активности, затрудненное дыхание, снижение веса). Кроме того, через 14 дней проведена эфтаназия нескольких мышей из контрольной группы (не леченых) и их паренхиматозные органы подвергались микроскопическому и микробиологическому исследованию. У животных на вскрытии обнаруживались множественные очаги туберкулезного воспаления в легких и селезенке. При бактериоскопическом исследовании в мазках обнаружены кислотоустойчивые микобактерии. Из паренхиматозных органов высевались микобактерии туберкулеза. Таким образом, отработанная модель туберкулеза характеризовалась выраженными и легко определяемыми патологическими, соответствующими стандартной модели туберкулеза.

Проведена отработка доз и режимов облучения. С этой целью проводилось облучение белых мышей аппаратом "Фтизио-Биофон" по общепринятой схеме с 10-, 30-, 50- и 100- кратным увеличением дозы. За оптимальный принят режим облучения в 30 раз.

Следующим этапом исследования было изучение сочетанного влияния излучения и противотуберкулезных препаратов на течение экспериментального туберкулеза.

В опыте использовано 6 групп белых мышей:

I группа – здоровые животные (контроль №1);

II группа – здоровые животные, получавшие облучение "Фтизио-Биофоном";

III группа – зараженные животные (контроль №1);

IV группа – зараженные животные получавшие облучение "Фтизио-Биофоном";

V группа – зараженные животные, леченые изониазидом;

VI группа – зараженные животные, получавшие сочетанное лечение изониазидом и облучение "Фтизио-Биофоном".

Лечение и облучение были начаты через 7 дней после заражения и проводилось 30 дней. Изониазид вводили раз в сутки подкожно из расчета 10мг/кг веса животных. Облучение проводили по отработанному режиму. После окончания опыта, выжившим животным проводили эфтаназию ингаляционным наркозом. На протяжении всего эксперимента проводили постоянное наблюдение за состоянием животных: поведением, потреблением корма, состоянием волосяного покрова и слизистых оболочек, изменением веса (еженедельное взвешивание).

Эффективность лечения определялась последующим показателям:

1. разница в весе мышей в начале и в конце опыта;
2. средний вес легких;
3. наличие специфических поражений в легких. Определялся индекс поражения легких, исчисляемый по 4-х бальной системе (от единичных слабовыраженных очагов - 1 балл до множественных крупных некротических очагов – 4 балла);
4. количество микобактерий в мазках их легочной ткани. Этот показатель также определялся в баллах: от одной микобактерии в 100 полях зрения – 1 балл до более 50 микобактерий в одном поле зрения – 4 балла.
5. Для подсчета микобактерий из легочной ткани готовили тонкие мазки размером 2х1,5 см, сушили на воздухе, фиксировали на огне о красили по методу Циля-Нильсена.

Для определения высеваемости микобактерий туберкулеза половину легкого каждой мыши растирали в фарфоровой ступке и заливали 5 мл 5% раствора серной кислоты. Полученную массу быстро переносили в центрифужную пробирку и центрифугировали в течение 10 минут при 3000 оборотов; затем серную кислоту сливали, в осадок добавляли несколько капель физиологического раствора и сеяли в 2 пробирки со средами Левенштейна-Иенсена и "Новая".

У мышей, как здоровых, так и зараженных, получавших лечение и облучение отмечено прибавление веса в конце опыта, причем различия в этом показателе между IV, V, и VI группами были незначительны. Исключение составила III группа (зараженные не леченные мыши), где средний вес снизился на 2,5 грамма по сравнению с первоначальным, что свидетельствовало о прогрессировании туберкулезной инфекции.

Результаты микроскопических и макроскопических исследований представлены в таблице 7. Из представленных в таблице 7 данных видно, что средний вес легких у животных, получавших изониазид (V группа) и получавших сочетанное лечение с облучением (VI группа) практически не отличался от такового у здоровых животных. У мышей, подвергшихся одному облучению он был несколько выше (292мг), оставаясь при этом значительно ниже в (1,4 раза), чем вес легких зараженных животных в контрольной группе.

Эффективность лечения изониазидом и аппаратом "ФтизиоБиофон" экспериментальной туберкулезной палочки

Таблица 8

Высеваемость МБТ из органов белых мышей

Специфические изменения в легких были отмечены у мышей контрольной III группы – множественные сероватые крупные очаги. У животных V и VI групп они не выявлены, а в IV группе у нескольких мышей обнаружены единичные микобактерии в поле зрения.

Культуральный метод исследования показал массивный рост МБТ при посеве гомогенатов легких и селезенки мышей контрольной группы через один месяц от момента засева (таблица 8). Процент положительных находок при посеве легких животных, облучаемых "Биофоном" был в два раза ниже, чем в контроле. Высевы из легочной ткани мышей, получавших лечение изониазидом без и в сочетании с облучением показали отсутствие или сниженную жизнеспособность микобактерий.

2.2.Изучение сочетанного влияния излучения и противотуберкулезных препаратов на развитие экспериментального туберкулеза у морских свинок.

В опыте использованы 15 половозрелых особей весом 270-300 г. Во время эксперимента животные содержались в стандартных условиях. С целью развития туберкулеза было проведено внутривенное заражение рекомендуемой дозой 1мг суспензии культуры лабораторного штамма H₃₇Rv. До проведения опыта всем животным была проведена проба Манту.

В опыте использовано 3 группы морских свинок:

I группа – зараженные животные (контроль);

II группа – здоровые животные, получавшие облучение "Фтизио-Биофоном";

III группа – зараженные животные, получавшие сочетанное лечение изониазидом и облучение "Фтизио-Биофоном".

Лечение и облучение были начаты на следующий день после заражения и проводились 30 дней. Изониазид вводили раз в сетки per os из расчета 10 мг/кг веса животных. Облучение проводили по отработанной в предыдущих опытах схеме. После окончания опыта, выжившие животные забивались, паренхиматозные органы подвергались макроскопическому и микробиологическому исследованию. Определялась фагоцитарная активность лейкоцитов по унифицированной методике методом инкубации культуры клеток с частицами латекса, а также по НТС – тесту (В.В. Меньшиков, 1987).

Данные макроскопических и микробиологических исследований представлены в таблицах 9 и 10. При макроскопическом изучении паренхиматозных органов не леченых свинок (контрольная группа) через 30 дней после заражения были обнаружены признаки туберкулезной инфекции. В легких определялось большое количество серых, хорошо выраженных очагов, у части животных – крупных некротических очагов. Печень и селезенка были увеличены в 2,0-2,5 раза, в них обнаружены множественные туберкулезные очаги.

Макроскопическая картина внутренних органов животных, получавших лечение, отличалась от контрольной группы. В легких морских свинок, облучаемых "Биофоном" определялись единичные некрупные серые очаги, в печени и селезенке – множественные мелкие туберкулезные очаги. У животных, получавших сочетанное лечение с облучением туберкулезные изменения были выражены слабо.

данные микроскопии практически подтвердили результаты макроскопических исследований. Количество микобактерий в мазках из легких свинок II и III групп было заметно снижено, по сравнению с контрольной. В то же время, посевы гомогенатов паренхиматозных органов животных контрольной группы и получавших только облучение в 100 % случаев дали положительный результат, в то время как при лечении изониазидом МБТ не высевались.

Изучение фагоцитарной активности нейтрофилов не выявило статистически достоверного отклонения показателей как до начала облучения, так и после него.

Облучение аппаратом "Биофон" не влияло на состояние лабораторных животных (поведение, потребление корма, состояние волосяного покрова, слизистых оболочек и т.д.), а также на показатели клеточного звена иммунитета.

Применение аппарата "Биофон" для лечения экспериментального туберкулеза позволяет снизить активность проявления специфических поражений. Сочетанное использование облучения с лечением изониазидом повышает химиотерапевтическую активность препарата.

Таблица 9

Эффективность лечения изониазидом и аппаратом "Фтизио-Биофон" экспериментальной туберкулезной инфекции.

Таблица 10

Высеваемость МБТ из органов морских свинок

3. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ИНФРАКРАСНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ АППАРАТА "ФТИЗИО-БИОФОН" НА БОЛЬНЫХ С УРОГЕНИТАЛЬНЫМ ТУБЕРКУЛЕЗОМ.

Урогенитальный туберкулез характеризуется длительным, хроническим течением, особенности которого зависят от сложности взаимоотношений между микобактериями туберкулеза и макроорганизмом больного. В зависимости от реактивности организма и вирулентности возбудителя течение заболевания может быть многообразным. Кроме того, развитие туберкулеза и специфическая терапия практически всегда приводят к изменению реактивности микроорганизма, что проявляется в разной степени выраженности нарушений иммунного статуса больного. Продолжительность антибактериальной терапии этой категории пациентов составляет более 12 месяцев. Зачастую достаточно трудно добиться стабильной ремиссии заболевания. Урогенитальный туберкулез чаще выявляется в зрелом возрасте (25-50 лет), всегда на фоне каких-либо неблагоприятных условий, в т.ч. хронические неспецифические заболевания мочеполовой системы.

Целью данного раздела работы являлось изучение возможности использования аппарата "Фтизио-Биофон" для лечения больных с урогенитальным туберкулезом.

За период нашей работы была отобрана группа больных (добровольцев) в количестве 15 человек. Отбор осуществлялся клиницистами после всестороннего обследования и с учетом донных клинико-лабораторных показателей. Все они получали стандартный курс антибактериальной терапии, а десять из них получали дополнительно инфракрасное облучение по стандартной схеме, отработанной нами в опытах на пробирках и при лечении экспериментального туберкулеза у лабораторных животных. За основу взята схема облучения, предложенная зав. кафедрой фтизиатрии медицинской академии г. Ижевска д.м.н., проф. Е.Е. Полушкиной. Нами увеличено количество одновременно получаемых сеансов до 10 и учтены временные параметры кратности облучения в сутки. Таким образом, рекомендуем стандартную схему облучения больных урогенитальным туберкулезом: 1 день – кратность облучения 4 раза с интервалом 6 чесов; 2 день – 3 раза с интервалов 8 часов; с 3 дня и по 7 – двукратно с интервалом 12 часов; с 8 дня и до 30 – однократно. Количество сеансов в каждом облучении равно 10.

В процессе выполнения работы изучалось влияние инфракрасного излучения на:

1. общеклинические и иммунологические показатели;
2. биохимические показатели;
3. данные бактериологических исследований.

Полученные результаты анализируются в следующих разделах этой главы.

1. Изучение влияния инфракрасного излучения на общеклинические и иммунологические показатели крови у больных с урогенитальным туберкулезом.

Были обследованы две группы больных (добровольцев). У всех методом посева на микобактерии туберкулеза до начала лечения исследована моча. Все получали стандартную антибактериальную терапию. В первой группе 10 пациентов с урогенитальным туберкулезом получали дополнительно инфракрасное облучение аппаратом "Фтизио-Биофон" по предложенной нами схеме. Остальные вошли в группу №2.

Забор крови для исследований производили до начала облучения и последующие каждые 10 дней. Определялись гематологические показатели: - гемоглобин унифицированным гемоглобинцианидным методом подсчета в камере Горяева; - скорость оседания эритроцитов унифицированным микрометодом Панченкова; - лейкограмма с окраской по Романовскому. Иммунограмма оценивалась по основным показателям: - относительное и абсолютное количество Т-лимфоцитов и их субпопуляций (теофиллинчувствительных и резистентных) методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана, - относительное и абсолютное количество В-лимфоцитов методом розеткообразования с эритроцитами мыши; - фагоцитарную активность нейтрофилов в НСТ – тесте и методом инкубации с латексом; - циркулирующие иммунные комплексы в сыворотке крови методом преципитации с 3,5% раствором полиэтиленгликоля с последующей колориметрией на спектрофотометре. Полученные результаты отражены в таблицах №11 и№12.

Таблица 11

Гематологические показатели больных урогенитальным туберкулезом

Таблица 12

Иммунологические показатели у больных урогенитальным туберкулезом

Анализируя полученные в ходе работы данные можно сделать вывод, что облучение аппаратом "Фтизио-Биофон" не оказывает значительного влияния на гематологические и иммунологические показатели крови больных урогенитальным туберкулезом.

3.2. Изучение биохимических сдвигов в организме больных урогенитальным туберкулезом под воздействием излучения аппарата "ФтизиоБиофон".

Биохимические показатели характеризуют основные физиологические функции систем организма и являются важными характеристиками безопасности воздействия излучения на организм больных урогенитальным туберкулезом.

Было обследовано 15 больных. Все получали стандартную антибактериальную терапию. 10 из них получали облучение по стандартной схеме и составили группу №1. Остальные вошли в группу №2. Изучались биохимические показатели, характеризующие функциональное состояние печени и почек:

1 – определение содержания общего белка в сыворотке крови унифицированным методом по биуретовой реакции (наборы реактивов фирмы Rajchem);

2 – определение глобулино-тимоло-липидного комплекса унифицированной тимоловой пробой в вероналовом буфере;

3 – определение фракций белков в сыворотке крови унифицированным методом электрофореза на бумаге;

4 – определение активности ферментов АлАТ и АсАТ с реактивами фирмы Rajchem;

5 – определение билирубина унифицированным методом по диазореакции по методу Jendrassjk L., Cleghorn R.;

6 – определение мочевины и креатинина унифицированными методами.

Результаты представлены в таблице №13.

Таблица 13

Биохимические показатели у больных урогенитальным туберкулезом

Как следует из данных, приведенных в таблице, выполненные биохимические исследования у больных с урогенитальным туберкулезом после воздействия на них инфракрасного излучения аппарата "ФтизиоБиофон" не выявили статистически значимых отклонений от физиологических норм показателей, характеризующих функции печени. Показатели функций почек не имеют статистически достоверной разницы между группами.

3.3. Бактериологическое обследование больных с урогенитальным туберкулезом (ограниченный контингент, добровольцы) на фоне облучения аппаратом "ФтизиоБиофон" в условиях стандартной терапии.

В условиях современного течения урогенитального туберкулеза необходимо учитывать сложность диагностики данного заболевания, зачастую позднюю выявляемость, и, следовательно, часто неэффективную терапию. Одним из основных звеньев постановки диагноза является бактериологическое исследование мочи на микобактерии туберкулеза.

Основным материалом для бактериологического обследования больных с урогенитальным туберкулезом служила вся порция утренней мочи, собираемая после тщательного туалета наружных половых органов в стерильную посуду. Баночки с мочой обрабатывались 70% этиловым спиртом, отстаивались 3 часа, после чего сливалась надосадочная жидкость и к осадку добавлялось равное количество 10% тринатрий фосфата с последующим отстаивание еще на 2 часа. После этого вновь сливалась надосадочная жидкость, а осадок переносился в центрифужную пробирку с последующим центрифугированием при 3000 об/мин. в течении 10-15 мин. после чего сливалась надосадочная жидкость, а к осадку добавляли 10%раствор тринатрий фосфата в соотношении 1:1 и термостатировали при 37 град. 18-24 часа. На следующий день пробирки доставали из термостата и снова центрифугировали при том же режиме. После слива надосадочной жидкости полученный осадок нейтрализовали 1% раствором лимонной кислоты в соотношении 1:1 и проводили посев остатка на три питательные среды, а оставшиеся две последние капли наносили на предметные стекла для покраски и микроскопирования на люминесцентном микроскопе "Люмам -ИЗ". Посев мочи проводился до начала и по окончании облучения. До начала облучения в первой группе из 10 больных 7 бактериовыделителей, во второй группе из 5 больных 3 бактериовыделителя. Поскольку облучение больных аппаратом "ФтизиоБиофон" проводилось на фоне стандартной антибактериальной терапии, а сбор материала на бактериологический посев целесообразно выполнять только на 3 день после отмены препарата, то контроль прекращения бактериовыделения был проведен только по окончании полного курса терапии. Окончательные результаты бактериологических посевов на микобактерии туберкулеза можно будет оценить не ранее 30 октября (находятся еще в работе). Отмечено, что в ходе проведения этой работы два пациента из г.№1 предъявляли жалобы на бессонницу, один был переведен в хирургическое отделение, у одного состояние здоровья ухудшилось (нарастала хроническая почечная недостаточность). Основная масса пациентов не предъявляла жалоб, не связанных с основным заболеванием.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований по изучению влияния аппарата "Биофон" на микобактерии, а также на организм экспериментальных животных и больных урогенитальным туберкулезом установлено:

1. Облучение аппаратом "Биофон" оказывает угнетающее воздействие на ростовую активность вирулентных штаммов МБТ, стимулируя рост авирулентных микобактерий в опытах in vitro. Выявлена прямая зависимость задерживающего эффекта развития бактерий от степени вирулентности.

Облучение аппаратом "Биофон" усиливает туберкулостатическое действие изониазида, стрептомицина и этамбутола на чувствительный тест-штамм МБТ. Кроме того аппарат "Биофон" оказывает определенное воздействие на степень устойчивости микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам. Наиболее существенные изменения отмечены в устойчивости к стрептомицину (повышение степени устойчивости), а также к рифампицину и канамицину (снижение степени устойчивости).

2. Воздействие аппарата "Биофон" на организм лабораторных животных: белых мышей и морских свинок не вызывает гибели животных, изменений в поведении, состоянии волосяного покрова и слизистых оболочек, отказа от корма и воды, потери в весе, а также на показатели клеточного звена иммунитета.

Применение аппарата "Биофон" для лечения экспериментального туберкулеза позволяет снизить активность проявления специфических поражений. Сочетанное использование облучения с лечением изониазидом повышает химиотерапевтическую активность препарата.

3. Использование облучения аппаратом "ФтизиоБиофон" для лечения больных урогенитальным туберкулезом (ограниченная группа, добровольцы) не оказывает значительного влияния на гематологические и иммунологические показатели крови.

Проведенные биохимические исследования у больных с урогенитальным туберкулезом после воздействия на них инфракрасного излучения аппарата "ФтизиоБиофон" не выявили статистически значимых отклонений от физиологических норм показателей, характеризующих функции печени.

Таким образом, облучение аппаратом "Биофон" микобактерий туберкулеза приводит к снижению их ростовой активности. Аппарат безвреден для экспериментальных животных и снижает активность туберкулезного процесса, усиливая действие противотуберкулезных препаратов. Облучение не оказывает выраженного вредного воздействия на организм больных урогенитальным туберкулезом, однако для полной и объективной оценки эффективности и безопасности препарата необходимо проведение дополнительных исследований на расширенном контингенте больных с этой патологией.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Васильев В.И. Микобактериозы и микозы легких – София, 1971, - 383 с.
2. Литвинов В.И.//Пробл. туберкулеза. – 1996. - №1. – с. 56-58.
3. Меньшиков В.В. // Лабораторные методы исследований в клинике – М., "Медицина". – 1987, с.106-310.
4. Методические указания по применению унифицированных микробиологических методов исследований при туберкулезе / Сост. Козулицина Т.Н., Смолянская А.З., Москвитина М.Г. – М., 1978. – 72 с.
5. Методические указания: Приготовление и использование новой питательной среды для выращивания микобактерий туберкулеза / Сост. Мордовской Г.Г. – М., 1972. – 9 с.
6. Першин Г.Н. Методы экспериментальной химиотерапии – М., "Медицина" – 1971. – с. 171-184.
7. Рудой Н.М. // Пробл. туберкулеза – 1996. - №3 – с. 6-8.
8. Хоменко А.Г.// Пробл. туберкулеза – 1996. - №3 – с. 2-6.