Влияние излучения аппарата “Уро-Биофон” на барьерные свойства цитоплазматических мембран бактериальных клеток.

В.М. Фомченков, Н.В. Борисов, А.Н. Байдусь, С.И.Петренко

Государственный научный центр прикладной микробиологии, 142279, пос. Оболенск, Московская обл.

Аппарат ИК-терапии урогенитальный “Уро-Биофон” (далее по тексту-аппарат), производства ГП “ИМЗ” (г. Ижевск), ТУ 9444-001-0196638-98, разработанный на основе российского патента, показал свою эффективность при лечении ряда инфекционных заболеваний и получил разрешение Минздрава на применение в клинике. Однако знание механизмов воздействия излучения прибора на различные функциональные системы клеток микроорганизмов еще недостаточно. Требуется проведение ряда систематических исследований для того, чтобы более полно понять, повреждение каких основных функций при облучении аппаратом, приводит к гибели клетки микроорганизмов.

Изменение барьерной функции цитоплазматической мембраны является одним из основных показателей повреждения клетки (1). Барьерные свойства цитоплазматической мембраны (ЦПМ) бактериальных клеток играют важную роль в поддержании их энергетического статуса и клеточного гомеостаза, а также в транспорте питательных веществ и выделении продуктов метаболизма.

В настоящей работе, с использованием ряда методов, исследовано изменение барьерной функции клеточных мембран после воздействия на них аппаратом.

Оценку изменения барьерных функций мембран проводили по ряду
показателей:

• спектрофотометрически, по оценке утечки УФ-поглощающих веществ;
• электроориентационной спектроскопии на установке "Ореол";
• методом клеточного электрофореза;
• поглощения радиоактивномеченных субстратов.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования были следующие бактерии: Escherichia coli К-12 и Chlamydia trachomatis. E. сoli выращивали в колбах на обогащенной глюкозопептонной среде при 37°С в течение 4 часов, логарифмическая фаза роста, и 12-14 часов, стационарная фаза роста культуры. Ch. trachomatis культивировали в желточных мешках 7-дневных куриных эмбрионов в течение 72 часов. Затем желточные мешки суспендировали в слабозабуференном физрастворе и осветляли центрифугированием при 2500-3000 g.

Определение снижения числа жизнеспособных клеток Е. coli проводился путем сравнения числа колониеобразующих единиц, выросших в течение суток при 37°С на плотной питательной среде контрольного и подвергнутого обработке аппаратом образца.

Оценки снижения жизнеспособных клеток Ch. trachomatis проводили путем сравнения минимальных разведений, вызывающих заражение эмбрионов.

Измерение утечки УФ-поглощающих веществ проводили путем измерения оптической плотности супернатанта, полученного после осаждения клеток микроорганизмов на центрифуге при 25000g, при 260 нм в 1 см кювете на спектрофотометре DU-7 фирмы Бекман. Контролем служил супернатант необработанных клеток.

Электроориентационная (Э0) спектроскопия клеток заключалась в анализе частотной зависимости их электроориентационного эффекта (ЭОЭ) в диапазоне частотпеременного электрического поля от десятков герц до десятков мегагерц. ЭОЭ определяют по изменению оптической плотности суспензии под действием переменного электрического поля, которое происходит из-за выстраивания клеток продольной осью вдоль или поперек силовых линий поля. Экспериментальная установка аналогична описанной ранее (2).

Электроповерхностные свойства клеток анализировали методом лазерной допплеровской спектроскопии на приборе "Zetasizer-2c" фирмы Маlvern, Англия.

Транспортные процессы изучали с применением 14С субстратов по методике описанной в книге (3).

В работе использовали u-14С-глюкозу (уд. акт. 1,0 мКи/ммоль) и u-14С-глутаминовую кислоту (4 мКи/ммоль).

Радиоактивность определяли на жидкостном сцинтилляционном счетчике “Ultrаbeta 1210”, ЛКБ.

Результаты и обсуждение

Исследование воздействия аппарата на клетки микроорганизмов проводили путем однократного и пятикратного облучения суспензии клеток в питательной среде, контролем служили клетки не подвергнутые облучению. Для того, чтобы избежать нежелательного воздействия аппарата на контрольные клетки, облучение проводили в помещении удаленном на 10 м от того в котором находился контрольный образец и проводились дальнейшие работы.

Сравнительное изучение изменения жизнеспособности клеток Е. сoli обработанных аппаратом представлены в таблице 1.

Таблица 1:

Влияние облучения аппаратом на жизнеспособность клеток Е. coli К-12

Как видно из представленных в таблице результатов при обработке аппаратом “Биофон” происходит значительное снижение числа жизнеспособных клеток E. Coli. Интересно отметить, что увеличение кратности обработки не приводит к дальнейшему снижению жизнеспособности.

При воздействии аппарата на клетки Ch. trachomatis наблюдали также увеличение минимальной заражающей дозы приблизительно на порядок относительно контроля. Следует отметить, что и в данном случае мы не получили увеличение степени воздействия аппарата при увеличении кратности обработки.

После обработки суспензии клеток аликвоту в объеме 3 мл центрифугировали на ультрацентрифуге и в супернатанте определяли поглощение при 260 нм, контролем служил супернатант необработанных клеток. Если поглощение супернатанта превышало оптическую единицу, то мы разводили его дистиллированной водой, так чтобы оптическая плотность находилась в диапазоне 0,3-0,8. Установлено, что облучение вызывает статистически достоверный прирост оптической плотности супернатанта на 20-30% для обеих микроорганизмов и вновь мы констатировали независимость этой цифры от кратности облучения.

В последние годы показана перспективность применения различных электрофизических методов, в частности электроориентационной спектроскопии, для анализа повреждения бактериальных клеток (4). Основным показателем повреждения клеток в этом слечае являются изменения в спектре электроориентации. Величина электроориентационного эффекта (ЭОЭ) на низких (менее 10 кГц) частотах определяется электроповерхностными свойствами клеток и параметрами двойного электрического слоя на границе раздела “клетка-окружающая среда”. На частотах выше 10 кГц величина ЭОЭ определяется барьерными свойствами клеточных мембран, а также концентрацией и подвижностью ионов цитоплазмы. Кроме того, во всем диапазоне частот величина ЭОЭ клеток, суспендированных в среде с определенной электропроводностью и рН, зависит от размера и формы клеток, а также показателя их преломления. Частотная зависимость ЭОЭ клеток называется электроориентационным (далее - ЭО) спектром и характеризует состояние клеточной поверхности (на низких частотах) и внутриклеточного содержимого (на высоких частотах).

В результате, сравнивая ЭО спектры интактных и обработанных на аппарате клеток можно оценить его воздействие на поверхностные структуры клеток и их влияние на барьерные свойства цитоплазматических мембран (ЦПМ). Следует иметь в виду, что из-за различий в ЭО спектрах интактных клеток разных видов и особенностей их изменения при повреждении клеток, оптимальный выбор частот в кило- и мегагерцовой области при определении изменения высокочастотного участка Э0 спектра, характеризуемого величиной β (ссылка предыдущая), может отличаться в зависимости от вида клеток и повреждающего фактора.

Относительное уменьшение величины β для клеток, обработанных исследуемым воздействием, в сравнении с контрольными (отрицательные значения Δβ/β), ρβидетельствуют о повреждении барьера проницаемости ЦПМ клеток.

На рис, 1-4 представлены ЭО спектры клеток Е. coli и на рис.5-6 ЭО спектры Ch. trachomatis, интактных и обработанных аппаратом, полученные сразу после облучения (рис.1,2 и 4) и через 6 часов после обработки (рис. 3,4 и 6). Для Е. coli снимали спектры энергизованных (глюкозой 0,2%) (рис 1 и 3), так и спектры неэнергизированных (рис 2 и 4) клеток. При этом рассчитывли Δβ/β (по значениям, определенным по величине ЭОЭ на частотах 0,1 и 10 мГц), значения которых представлены в таблице 2.

Значения параметра Δβ.β (%) клеток Е. coli , полученные при их обработке аппаратом в присутствии глюкозы (глю+) и без нее (глю-).

Из приведенных выше данных видно, что облучение клеток аппаратом сводится к двум основным эффектам. Во-первых, заметно изменяются электроповерхностные свойства клеток на низких частотах: как правило, у обработанных клеток низкочастотный участок Э0 спектра проходит гораздо ниже чем у интактных. Исключение составил ЭО спектр энергизированных клеток через 6 часов после облучения (рис. 3), когда низкочастотный участок спектра располагался выше, чем у интактных клеток. Во-вторых, в области высоких частот наблюдались более или менее выраженные изменения, характерные для нарушения барьерных свойств ЦПМ бактериальных клеток (отрицательные значения параметра Δβ/β).έςξς эффект сильнее выражен у энергизированных клеток сразу после облучения и увеличивается с течением времени (через 6 часов после облучения).

Значение электрокинетического потенциала интактных и обработанных клеток, измеренные в фосфатно-цитратном буфере рН 7,0 и 2,6 при ионной силе 0,02 представлены в таблице 3.

Таблица 3:

Дзета-потенциал (мВ) клеток Е. coli до (К) и после (О) облучения аппаратом

Из табл. 3 видно, что облучение клеток не приводило к значительному изменению дзета-потенциала, за исключением дзета-потенциала энергизованных клеток при рН 2,6 через пять часов после их обработки. Последнее коррелирует с аномальным изменением низкочастотного участка ЭО спектра тех же клеток (рис. 3). По-видимому, эти особенности связаны с утечкой веществ из клеток и их адсорбцией на клеточной поверхности. Возможность этого подтверждается большими отрицательными значениями Δβ/β σ ύςθх клеток (табл. 2).

Таким образом и ЭО спектроскопия выявила заметное изменение электроповерхностных свойств клеток, подвергнутых облучению аппарата. Изменение Э0 спектров облученных клеток в области высокочастотного спада спектра свидетельствует о небольшом, но заметном нарушении барьерных свойств ЦПМ этих клеток (в сравнении с покоящимися) и его величина возрастает с течением времени после облучения клеток. Данные клеточного электрофореза свидетельствуют о том, что дзета-потенциал клеток после облучения если и меняется, то незначительно.

Была предпринята попытка оценить, как изменение барьерных свойств ЦПМ влияет на скорость поглощения питательных веществ из среды.

Для этого клетки осаждали центрифугированием и суспендировали в 0,1 М фосфатном буфере. К суспензии добавляли 0,2% глюкозы или глутаминовой кислоты с добавкой радиоактивномеченных аналогов. После инкубации в течении 30 мин отбирали аликвоты и наносили на фильтр 0,22 мкм. Фильтр промывали буферным раствором для удаления радиоактивных примесей из среды и определяли радиоактивность клеток на жидкостном сцинтилляционном счетчике. После этого фильтр дополнительно промывали 10% холодной трихлоруксусной кислотой и вновь определяли радиоактивность. Разность между двумя определениями принималась как количество субстрата, включившегося в полимерные компоненты клетки. Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4:

Поглощение радиоактивномеченных субстратов интактными и облученными клетками Е. соli.

Как видно из представленных результатов, облученные клетки даже несколько более активно поглощают субстрат из среды, особенно это заметно для глюкозы. Однако скорость включения метки из субстрата в полимерные компоненты резко падает. Вероятно это связано со снижением скорости биосинтетических процессов в облученных клетках.

Подводя общий итог можно сделать следующие достаточно обоснованные выводы:

облучение аппаратом “Биофон” приводит к изменению проницаемости ЦПМ; клетки в результате такой обработки получают сублетальные повреждения и их дальнейшая судьба зависит от того сумеют они восстановить поврежденные системы или нет.

Литература

1.Никольский Н.Н. В кн.: Общие механизмы клеточных реакций на повреждающие воздействия. Вып. 17. Л.: 1977, с. 23.

2.Иванов А.Ю., Фомченков В.М., Мирошников Ф.И. // Электронная обработка материалов. 1984. N 4. с.53.)

3.Остерман Л.А. Исследование биологических микромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М.: Наука, 1983. с. 213)

4.Мирошников А.И., Фомченков В.М., Иванов А.Ю. Электрофизический анализ и разделение клеток. М.: Наука, 1986. 184 с.).